Конкурентные ингибиторы

Конкурентные ингибиторы ФЛА2 - это аналоги субстратов, продуктов реакции или комплекса переходного состояния. Они конкурируют с субстратом за связывание с активным центром молекулы Е*, эффективно понижая концентрацию комплекса ES*. Этот механизм ингибирования был экспериментально подтвержден при изучении катализа фосфолипидов под действием ФЛА2 по типу "scooting".

Общепринятая стратегия создания ингибиторов состоит в замене чувствительной к ФЛА2 сложноэфирной связи на негидролизуемую группу. При этом ингибитор должен оставаться близким структурным аналогом субстрата и не вызывать изменений в липидных мембранах. В настоящий момент не представляется возможным сопоставить имеющиеся данные о конкурентных ингибиторах, поскольку еще не выработано единой теории и количественного описания липолиза на границе раздела фаз липид/вода.

Аминоацильные фосфолипиды. Среди фосфатидилхолинов с модификацией.sn-2-сложноэфирной связи был открыт класс мощных конкурентных ингибиторов ФЛА2 - sn-2-амидных аналогов. Замена sn -2-сложноэфирной связи на простую эфирную связь или на углеводородный остаток также приводила к ингибированию ФЛА2 по конкурентному типу, но в меньшей степени.

Влияние аминоацильных аналогов фосфолипидов на ферментативную активность ФЛА2, исследовалось, в основном, в модельных экспериментах со смешанными мицеллами при соблюдении следующих условий:

1)общая концентрация липидов (ингибитора и субстрата) [I] + [S] должна быть постоянной для расчета мольной доли ингибитора, α = [I]/([I] + [S]);

2)молекулы субстрата и ингибитора должны занимать одинаковую площадь на межфазной поверхности;

3)межфазная поверхность мицелл должна быть достаточно большой, чтобы фермент находился только в связанной форме.

Для оценки воздействия ингибитора на активность ФЛА2 была использована условная величина ингибиторной силы (Z), которая является мерой соотношения констант межфазной диссоциации для субстрата и ингибитора и определяется выражением:

Rv = I + αZ,

где Rv - отношение скорости реакции при К≠Кm к скорости реакции при Кi = Кm, α - мольная доля ингибитора в мицелле.

Изучали также ингибиторное действие (R)-1- алкил-2-ациламино-1,2-дидезоксиглицеро-З-фосфохолиновых аналогов на панкреатические фосфолипазы млекопитающих. Среди ингибиторов с насыщенными жирнокислотными цепями наибольшую активность имели аналоги с С10-ацильными цепями. Поведение ненасыщенных аналогов было более сложным как в цвиттерионных, так и в анионных ингибиторах, увеличение числа цис-двойных связей при их определенном расположении в ацильной цепи приводило к возрастанию параметра Z [80].

В ходе исследований стиоамидными аналогами субстратов выяснилось, что тиоамидный аналог фосфатидилэтаноламина с lС50=4.5 * 10-7 М является самым сильным из известных ингибиторов ФЛА2.

Исследования, проведенные с аминоацильными ингибиторами, выявили некоторые аспекты взаимодействия фермент/липид:

1) Введение амидного остатка в sn-2-положение фосфолипида значительно увеличивает его связывание с каталитическим центром ФЛА2: более нуклеофильный атом кислорода амидной группы способен сильнее взаимодействовать с электрофилом этого центра (предположительно, Са2+). Амидная группа предоставляет лучшие возможности и для водородного связывания.

2) α-Метиленовая группа ацильного остатка sn-2-положении фосфолипида отвечает за связывание фосфолипида с каталитическим центром фермента.

3) Увеличение гидрофобности функциональной группы sn-1-положении фосфолипида повышает сродство между ферментом и субстратом.

4) Фосфатидилэтаноламииы оказались более сильными ингибиторами, чем фосфатидилхолины.

Подход к синтезу оптически активных 1-ацил- 2-ациламино-2-дезоксиглицерофосфохолинов основывается на сохранении хиральности исходного соединения (L-серина) на протяжении всего синтеза. Выбранная последовательность введения заместителей предполагает использование минимального числа защитных групп. Также разработан стереоспецифический метод синтеза 1-алкил-2-ациламино-2-дезоксиглицерофосфохолинов исходя из L-серина. Введение алифатической алкильной группы осуществляют взаимодействием метансульфоната жирной кислоты с оксазолинзащищенным дезоксиглицеридом. Рацемические длинноцепочечные ациламиноаналоги фосфолипидов предложено получать исходя из 2-аминопропанола. Описан синтез оптически активного тиоамидного аналога фосфатидилхолина.