Методика количественного определения суммы флавоноидов в растительном сырье спектрофотометрическим методом

При оценке качества растительного сырья и фитопрепаратов, содержащих флавоноиды, наибольшее распространение получил спектрофотометрический метод анализа, основанный на использовании реакции комплексообразования флавоноидов с алюминия хлоридом. Фотометрический метод определения без предварительного разделения компонентов основан на аддитивности значений оптической плотности всех компонентов смеси при одной длине волны. Метод достаточно прост в исполнении, является высокочувствительным и относительно недорогим, что делает его предпочтительным для использования в контрольно-аналитических лабораториях. Использование такого метода позволяет определить сумму флавоноидов в присутствии других полифенольных соединений, не образующих комплекса с алюминием хлорида в среде 30-96% спирта [24].

В качестве стандарта используется тот флавоноид (рутин, кверцетин, гесперетин и т.д.), максимум поглощения комплекса которого наиболее соответствует максимуму поглощения комплекса с хлоридом алюминия исследуемого образца.

В дипломной работе в качестве стандарта использовался ГСО рутина и ГСО кверцетина, так как максимумы поглощения комплексов с хлоридом алюминия рутина/кверцетина и экстрактов боярышника, пустырника и календулы наблюдаются при наиболее близких значениях длин волн.

Измерение оптической плотности проводят на спектрофотометре ПЭ-5300В в интервале длин волн 408-616 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм.

Оборудование, материалы и реактивы:

- мерная колба объемом 100 см3 – 1 шт.;

- мерные колбы объёмом 25 см3 – 6 шт.;

- пипетки объёмом 1 см3– 3 шт.;

- пипетки объёмом 5 см3 – 1 шт.;

- мерный цилиндр объемом 100 см3;

- часы;

- кюветы на 10 мм;

- спектрофотометр ПЭ-5300В;

- экстракт пустырника;

- экстракт боярышника;

- экстракт календулы;

- алюминия хлорид 5%;

- спирт этиловый 70%;

- спирт этиловый 95%.

Подготовка к анализу

1) Приготовление 5%-го раствора алюминия хлорида

5 г алюминия хлорида х.ч. или ч.д.а. (ГОСТ 3759-75) растворяют в 50 мл 95% спирта в мерной колбе на 100 мл, доводят объём раствора этим же спиртом до метки и перемешивают.

Срок годности раствора 3 месяца.

Для анализа было приготовлено 250 мл 5% раствора алюминия хлорида в 70% спирте.

2) Приготовление 70%-го этилового спирта

Для приготовления 1л 70% этилового спирта смешивают 675 г этилового спирта 95% и 325 г воды. В объемных единицах 95% этилового спирта – 855 см3, воды – 325 см3. После приготовления раствора проверяют его плотность или объемную долю спирта ареометром (ГОСТ 3639-79).

3) Приготовление экстрактов

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 0.5 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 70% спирта этилового. Колбу взвешивают с погрешностью ±0.01 г, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают в термостате при температуре 60 °С в течение 2 ч. После охлаждения до комнатной температуры колбу вновь взвешивают и доводят до первоначальной массы 70% спиртом этиловым. Содержимое колбы фильтруют через воронку диаметром 7 см с вложенным ватным тампоном, отбрасывая первые 20 мл фильтрата [21].

Проведение спектрофотометрического анализа

В мерную колбу вместимостью 25 мл, предварительно взвешенную, переносят с помощью пипетки аликвоту анализируемого экстракта, равную 1 мл, и вновь взвешивают. В колбу с помощью пипетки добавляют 4 мл 5% раствора хлорида алюминия. Для приготовления раствора сравнения во вторую колбу вместимостью 25 мл с помощью пипетки переносят аликвоту (1 мл) анализируемого экстракта, после чего объем обеих колб доводят до метки 70% спиртом и оставляют на 30 мин. В случае помутнения растворов их фильтруют через бумажные фильтры в чистые стаканы.